Enregistré en six jours entre juin et août 1965, l'album encadre le concert de Newport de part et d'autre. Il ouvre sur Like a Rolling Stone et se ferme sur les onze minutes de Desolation Row, seul titre entièrement acoustique.

Enregistré en six jours à peine entre juin et août 1965, Highway 61 Revisited encadre le concert électrique de Newport et pousse jusqu'au bout la logique amorcée sur la face électrique de Bringing It All Back Home : cette fois, tout le disque — à l'exception de la longue Desolation Row, seul titre entièrement acoustique — est électrique, porté par l'orgue improvisé d'Al Kooper et la guitare de Mike Bloomfield.
Like a Rolling Stone ouvre le disque et le résume : plus de six minutes, une durée que la radio de l'époque juge inconcevable pour un single, un texte qui naît d'un long déversement de prose que Dylan ramène ensuite à la forme couplet-refrain. Columbia hésite, sort d'abord le titre coupé en deux faces d'un 45 tours, avant de céder devant la demande des disc-jockeys qui préfèrent diffuser la version intégrale. Le morceau atteint la deuxième place du Billboard et déplace durablement la limite de ce qu'une chanson populaire peut se permettre en matière de longueur comme de contenu.
Le titre de l'album renvoie à une route bien réelle, qui traverse le Minnesota natal de Dylan avant de descendre jusqu'au delta du Mississippi berceau du blues — une manière de relier sa propre origine à l'histoire de la musique américaine qu'il recompose ici à sa manière, mi-blues électrique, mi-vision biblique et carnavalesque. Ballad of a Thin Man, portrait au vitriol d'un journaliste dépassé par ce qu'il tente de comprendre, cristallise l'hostilité que Dylan commence à ressentir face à la presse.
Considéré par une large partie de la critique comme l'un des sommets absolus de sa discographie, Highway 61 Revisited referme, avec sa face jumelle Bringing It All Back Home, la période où Dylan a le plus radicalement redessiné les frontières de la chanson populaire — un travail qu'il va encore approfondir, quelques mois plus tard, sur le double album de Blonde on Blonde.
Les sessions se tiennent au Studio A de Columbia, à New York. Tom Wilson produit la première, dont sort Like a Rolling Stone ; Bob Johnston prend la suite pour les cinq jours d'août.
Le personnel change d'un titre à l'autre : Mike Bloomfield à la guitare, Al Kooper à l'orgue, Paul Griffin puis Frank Owens au piano, Bobby Gregg à la batterie. Desolation Row est refaite en fin de parcours avec Charlie McCoy à la guitare d'accompagnement.